Anh em cho hỏi về máy so màu quang phổ Varian Cary 50 Conc, Bio-Rad 18cell

[viva.dawnsun]

Mình hiện đang phân tích Cholinesterase trong não, cơ bằng máy so màu quang phổ Varian Cary 50 Conc, Bio-Rad (18cell) của Úc, trong 3 phút với bước sóng 412 anh chị nào có quy trình đó chính xác của máy này làm ơn giúp dùm, vì hiện tại hơi phiền phức ở chỗ chuẩn mẫu blank, theo cán bộ hướng dẫn thì đầu tiên sẽ cho máy chạy zero mẫu buffer pH7.4(sodium phosphate) trước sau đó chạy mẫu blank (gồm DTNB + buffer + cơ chất) nhưng có khi gặp rắc rối là mẫu blank ra kết quả âm nên phải chạy lại blank khác hoặc chạy zero lại, có khi vẫn không được thì cán bộ lại thay thế mẫu chạy zero là buffer bằng nước cất.Có khi phải lặp lại nhiều lần mới ra kết quả blank dương thì mới có thể bắt đầu đo mẫu não được làm tốn nhiều thời gian. Mình có cảm giác cán bộ hướng dẫn không chắc chắn lắm về quy trình (quy trình do phía Đan Mạch tài trợ hướng dẫn). Xin anh chị có kinh nghiệm chỉ giáo giúp.
Thứ 2 là đơn vị ABS có phải viết tắt của chữ Absorbance (độ hấp thu) không? Cám ơn!

[tigerchem]

Em nghĩ mình chạy blank thôi, không chạy zero ^^
Một phần chắc do máy không ổn định, anh xem lại nguồn điện cung cấp cho máy, điện chập chờn thì máy cũng chập chờn theo.
Thứ hai do chất lượng nước và cuvet. đảm bảo nước không bị đục, cuvet sạch, mỗi lần chạy xong thì rửa kĩ.
Cuối cùng đánh siêu âm toàn bộ dung dịch trước khi đo nếu thấy cần thiết.
ABS là viết tắt của độ hấp thu.
Thân

[ngvtuan]

Mình hiện đang phân tích Cholinesterase trong não, cơ bằng máy so màu quang phổ Varian Cary 50 Conc, Bio-Rad (18cell) của Úc, trong 3 phút với bước sóng 412 anh chị nào có quy trình đó chính xác của máy này làm ơn giúp dùm, vì hiện tại hơi phiền phức ở chỗ chuẩn mẫu blank, theo cán bộ hướng dẫn thì đầu tiên sẽ cho máy chạy zero mẫu buffer pH7.4(sodium phosphate) trước sau đó chạy mẫu blank (gồm DTNB + buffer + cơ chất) nhưng có khi gặp rắc rối là mẫu blank ra kết quả âm nên phải chạy lại blank khác hoặc chạy zero lại, có khi vẫn không được thì cán bộ lại thay thế mẫu chạy zero là buffer bằng nước cất.Có khi phải lặp lại nhiều lần mới ra kết quả blank dương thì mới có thể bắt đầu đo mẫu não được làm tốn nhiều thời gian. Mình có cảm giác cán bộ hướng dẫn không chắc chắn lắm về quy trình (quy trình do phía Đan Mạch tài trợ hướng dẫn). Xin anh chị có kinh nghiệm chỉ giáo giúp.
Thứ 2 là đơn vị ABS có phải viết tắt của chữ Absorbance (độ hấp thu) không? Cám ơn!

bạn lưu ý: mẫu trắng (blank) là DTNB và SET Zero. tốt nhất giữ nhiệt độ ổn định ở 24oC +-0.5oC

mình gửi bạn phương pháp xác định Cholinesterase. bên mình hiện có quy trình khá đầy đủ như sau:

A. Principle
Whole blood is diluted with pH 8.0 phosphate buffer and analyzed by an enzymatic method with acetylthiocholine as substrate. In presence of enzyme, acetylthiocholine yields thiocholine + acetate. Thiocholine is reacted with dithiobisnitrobenzoate to form yellow reaction product, thionitrobenzoic acid, which is monitored at 412 nm. Activity is calculated as µmoles of substrate hydrolyzed per mL of whole blood per min, µmole/mL/min.

B. Apparatus
(a) HITACHI UV-2900 Spectrophotometer, with Electronic thermostatted
cell holder.—Set at 412 nm for assay (410 nm for evaluation of spectrophotometer performance). double (preferred) beam, sensitive to 0.001 absorbance unit. With recording.
device to monitor absorbance change vs time.
(b) Cuvets.—1 cm, optical glass or disposable polystyrene.
(c) pH meter.—Accurate to 0.01 pH unit. Calibrate according to manufacturer’s instructions.

C. Reagents
(a) External control. —SeraChem Level 1 Clinical Chemistry Control Serum (Human) (Fisher Scientific), or equivalent normal serum control. Perform 10 or more replicate determinations to establish mean value. Acceptable range is ± 10% of that mean.
(b) Potassium hydroxide solution.—0.05N KOH. Dissolve 3.3 g reagent grade (85%) KOH in sufficient water to make 1 L.
(c) Chromate solution.—0.0400 g K2CrO4/L 0.05N KOH.
(d) Phosphate buffer solutions.—All solutions must be at room temperature prior to pH adjustment.
(1) Dibasic sodium phosphate solution.—0.1M. Dissolve 26.808g Na2HPO4•7H2O in water and dilute to 1 L.
(2) Monobasic potassium phosphate solution.—0.1M. Dissolve 13.609 g KH2PO4 in water and dilute to 1 L.
(3) Phosphate buffer, pH 7.0.—To 100 mL reagent 1, add sufficient reagent 2 (ca 150 mL) to adjust to pH 7.00. Keep solution refrigerated.
(4) Phosphate buffer, pH 8.0.—To ca 450 mL reagent 1, add sufficient reagent 2 (ca 50 mL) to adjust to pH 8.00. Keep refrigerated for long term storage. Warm to room temperature before use.
(e) Acetylthiocholine iodide (ATCI) solution. —0.075M. Dissolve 0.10835 g ATCI (Sigma Chemical Co. No. A 5751) in water and dilute to 5 mL. Keep frozen when not in use.
(f) Dithiobisnitrobenzoic acid (DTNB) solution.—0.01M. Dissolve 0.0396 g DTNB (Sigma Chemical Co. No. D 8130) in ca 9 mL pH 7.0 phosphate buffer, add ca 15 mg NaHCO3, and dilute to 10 mL with same buffer. Keep frozen when not in use.

D. Spectrophotometer Evaluation
Set wavelength to 410 nm. Adjust absorbance to zero with water in both sample and reference cuvets. Remove water from sample cuvet, rinse cuvet 3 times with ca 0.5 mL portions of K2CrO4 solution, and then fill cuvet with same solution. Absorbance reading at 410 nm should be 0.186–0.210. If reading is not within this range, recheck instrument performance before proceeding and, if necessary, recalibrate instrument according to manufacturer’s specifications

E. Preparation of Control and Sample Solutions
Prepare human serum control according to manufacturer’s instructions. Dilute well-mixed whole blood 1:1000 with pH 8.0 phosphate buffer (buffer should be 22.0–25.5°): Dilute 10 µL whole blood to 10 mL or 100 µL to 100 mL if 10 µL pipettor is not known to be accurate for blood. (Note: If air-displacement pipet is used, follow procedure for viscous samples.) Pipet 3 mL well-mixed, diluted blood into cuvet. Prepare second cuvet identical to first to serve as blank.

F. Determination
All reagents must be allowed to reach ambient laboratory temperature before performing assay; acceptable limits are 22.0–25.5°.
Add 50 µL DTNB to each cuvet and mix well. Place 1 cuvet in sample position and one in blank position. Set to zero absorbance at 412 nm.
Add 20 µL ATCI reagent to sample cuvet only and mix well. Follow absorbance increase over time. Allow 60-s delay prior to first reading to ensure linearity of reaction. Let reaction proceed minimum of 5 min and record A every 60 s. Calculate change in A for each time interval. A/min should be constant to ensure linear kinetics. Correlation coefficient (R2) for plots of A vs time should be 0.95–1.00.

Run external control in similar manner. Repeat assay if control value is not within acceptable range.

[viva.dawnsun]

Cám ơn phần trả lời của các anh rất nhiều!

@tigerchem: điều kiện đo là rất lý tưởng, cuvet em rửa rất kỹ + không trầy, điện rất ổn định vì lab của em dùng điện từ trạm biến áp riêng của trường. Em nghĩ cần set zero trước chứ, việc zet zero cũng cho mình bít tình trạng máy có đạt chưa trước khi bắt đầu tiến hành đo mẫu. Nếu dung dịch blank kết quả âm so với zero là điều bất thường vì hóa chất lại trong hơn cả dung dịch zero là sai. Điều đắn đo lnhiều à dung dịch set zero và dung dịch chạy blank chính xác là gì?

@ngvtuan: không hiểu sao quy trình anh đưa lại nhiều điểm khác với của em (em đang phân tích ChE não và cơ cá rô phi). Bước sóng thì giống là 412 nm trong 3-10 phútDung dịch buffer của em là Sodium phosphate có pH là 7.4 chứ không phải là 8.0 như của anh, blank thì gồm 900µl DTNB + 50µl buffer + 50µl cơ chất (mẫu thì gồm 900µl DTNB + 50µl dung dịch nghiền của mẫu đã ly tâm 10000 rpm trong 10 phút+ 50µl cơ chất). Em đắn đo nhiều ở chỗ cán bộ hướng dẫn có khi dùng mẫu set zero là sodium phosphate, khi blank âm lại dùng là nước cất hoặc ngược lại, mang tính may rủi nhiều quá có khi chạy đi chạy lại gần chục lần mới ra blank dương được. Như em đã nêu trên đây là quy trình từ phía nhà tài trợ Đan Mạch chuyển giao.

[ngvtuan]

@ngvtuan: không hiểu sao quy trình anh đưa lại nhiều điểm khác với của em (em đang phân tích ChE não và cơ cá rô phi). Bước sóng thì giống là 412 nm trong 3-10 phútDung dịch buffer của em là Sodium phosphate có pH là 7.4 chứ không phải là 8.0 như của anh, blank thì gồm 900µl DTNB + 50µl buffer + 50µl cơ chất (mẫu thì gồm 900µl DTNB + 50µl dung dịch nghiền của mẫu đã ly tâm 10000 rpm trong 10 phút+ 50µl cơ chất). Em đắn đo nhiều ở chỗ cán bộ hướng dẫn có khi dùng mẫu set zero là sodium phosphate, khi blank âm lại dùng là nước cất hoặc ngược lại, mang tính may rủi nhiều quá có khi chạy đi chạy lại gần chục lần mới ra blank dương được. Như em đã nêu trên đây là quy trình từ phía nhà tài trợ Đan Mạch chuyển giao.

quy trình anh đưa trên làm theo "AOAC Offocial Method 991.10",

không biết bên em làm theo tiêu chuẩn gì ?, em cần đưa phương pháp phân tích bên em như thế nào và theo tiêu chuẩn gì thì mọi người mới giúp em chính xác được.

[Teppi]

Hi,

Theo như mình hiểu, bạn đang thực hiện phân tích hoạt tính của men ChE như một cách theo dõi và so sánh mức độ nhiễm chất bảo vệ thực vật gốc lân hũu cơ như Filitox, Azodrin, Cidi, Sherpa, Arivo, Supraci, Basudin 50EC.

Cách của bạn làm theo phương pháp được phát triển bởi George Ellman năm 1961. sau đó được hoàn chỉnh thành phương pháp thực hành theo AOAC Official Method 991.10.

Xin trích đoạn nội dung phương pháp này từ :
Ellman GL, Courtney KD, Andres V, Jr., Feather-Stone RM (1961) A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol 7:88-95.: 88-95.

như sau:

Methodology

Reagents
1. 0.1M Phosphate buffer
Solution A: 5.22g of K2HPO4 and 4.68g of NaH2PO4 are dissolved in 150 ml of distilled
water.
Solution B: 6.2g NaOH is dissolved in 150ml of distilled water.
Solution B is added to solution A to get the desired pH (pH 8.0 or 7.0) and then finally the volume is made up to 300ml with distilled water.
2. DTNB Reagent
39.6 mg of DTNB with 15 mg NaHCO3 is dissolved in 10 ml of 0.1M phosphate buffer
(pH 7.0).

3. Acetylthiocholine (ATC)
21.67 mg of acetylthiocholine is dissolved in 1ml of distilled water.

ASSAY PROCEDURE
1. Dissection: Adult Male Wistar rats (250-300g body weight) are used for the experiment. The rats are decapitated; brains are removed quickly and placed in ice-cold saline. Frontal cortex, hippocampus and septum (and any other regions of interest) are quickly dissected out on a petri dish chilled on crushed ice.
2. The tissues are weighed and homogenized in 0.1M Phosphate buffer (pH 8).
3. 0.4ml aliquot of the homogenate is added to a cuvette containing 2.6 ml phosphate buffer (0.1M, pH 8) and 100µl of DTNB.
4. The contents of the cuvette are mixed thoroughly by bubbling air and absorbance is
measured at 412 nm in a LKB spectrophotometer. When absorbance reaches a stable value, it is recorded as the basal reading.
5. 20µl of substrate i.e., acetylthiocholine is added and change in absorbance is recorded for a period of 10 mins at intervals of 2 mins. Change in the absorbance per minute is thus determined.
Calculations: The enzyme activity is calculated using the following formula;
R = 5.74x 10-4 x A/CO
Where,
R = Rate in moles of substrate hydrolyzed /minute / gm tissue
A = Change in absorbance / min
CO = Original concentration of the tissue (mg / ml).

Vậy pH đệm là 8.0, bước sóng đo là 412nm.

Thân,

Teppi

[viva.dawnsun]

Anh Admin hay thế, cám ơn anh. Em xem profile anh thấy làm bên quản lý chất lượng! À chính xác anh à, em đang làm đề tài về thuốc trừ sâu gốc lân (hoạt chất Quinalphos - tên thương mại thuốc là Kinalux 25EC),khảo sát mức độ nhạy cảm của ChE với thuốc ở các thời điểm ấn định trước (và gồm 4 nghiệm thức nồng độ 0,10,50 và 70% LC50).
Sẵn cũng xin reply bên anh ngvtuan luôn là em đã hỏi cán bộ hướng dẫn thì họ trả lời là không biết đang theo tiêu chuẩn gì, chỉ làm theo quy trình bên Đan Mạch chuyển giao cho thôi và theo quy trình này thì có hơi khác với 2 anh. Theo đề cương thì là phân tích theo phương pháp Ellman 1961 có bổ sung, hướng dẫn buffer ph là 7.4. Em cũng vào aoac xem thử http://www.aoac.org/oma_revision/toc.htm đúng là AOAC Official Method 991.10 pH 8.0. Có lẽ em đang theo phương pháp Ellman dùng pH 7.4, em có search thử, cũng có bài nói về hạn chế của pp này http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6W9V-4PB0PPP-1&_user=10&_coverDate=11%2F15%2F2007&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1376606699&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=bc7d4d77d4345165c579136ed4aff2c4

Như em đã nêu có cái trục trặc lớn là chuyện dùng mẫu set zero, có khi cán bộ hướng dẫn dùng là nước cất, khi lại là buffer, thấy chạy đi chạy lại nhiều lần vất vả quá hôm nay cán bộ lại lấy mẫu blank (900µl DTNB + 50µl buffer + 50µl cơ chất) để set zero luôn. :03: Em thấy hơi đắn đo 1 số vấn đề: Em nghỉ set zero là để máy lấy cái mốc từ đó mình đo blank và đo mẫu. Lấy Abs mẫu trừ cho Abs blank sẽ ra 1 Abs chênh lệch là Abs do chính ChE trong mẫu phản ứng tạo màu sậm hơn gây. Nhưng không hiểu là tại sao rất nhiều lần set zero là nước cất hay buffer thì lại ra giá trị âm - tại sao blank màu vàng thế kia lại cho ánh sáng xuyên qua nhiều hơn hơn cả nước cất được !!??
Con dùng mẫu blank để set zero theo suy nghĩ của em nó sẽ ra kết quả không chính xác vì set zero chỉ lấy 1 giá trị tức thời trong 1 lần chiếu sáng làm mốc, mà theo em thấy thì mẫu blank có phải ứng tạo màu thay đổi dần dần chứ không phải là 1 màu cố định (em theo dõi biểu đồ hôm trước đo mẫu blank thấy Abs thay đổi liên tục trong thời gian 3 phút đo), đo trong 3 phút là để nó lấy các giá trị Abs của nhiều lần chiếu sáng đưa vào công thức những thay đổi màu đó rồi đưa ra 1 giá trị Abs/min cuối cùng (em đang search công thức đó nhưng chưa ra). Do đó việc lấy mẫu blank làm zero sao chính xác được.

Một số suy nghĩ như trên làm ơn cho em xin ý kiến!

[giotnuoctrongbienca]

Anh Admin hay thế, cám ơn anh. Em xem profile anh thấy làm bên quản lý chất lượng! À chính xác anh à, em đang làm đề tài về thuốc trừ sâu gốc lân (hoạt chất Quinalphos - tên thương mại thuốc là Kinalux 25EC),khảo sát mức độ nhạy cảm của ChE với thuốc ở các thời điểm ấn định trước (và gồm 4 nghiệm thức nồng độ 0,10,50 và 70% LC50).
Sẵn cũng xin reply bên anh ngvtuan luôn là em đã hỏi cán bộ hướng dẫn thì họ trả lời là không biết đang theo tiêu chuẩn gì, chỉ làm theo quy trình bên Đan Mạch chuyển giao cho thôi và theo quy trình này thì có hơi khác với 2 anh. Theo đề cương thì là phân tích theo phương pháp Ellman 1961 có bổ sung, hướng dẫn buffer ph là 7.4. Em cũng vào aoac xem thử http://www.aoac.org/oma_revision/toc.htm đúng là AOAC Official Method 991.10 pH 8.0. Có lẽ em đang theo phương pháp Ellman dùng pH 7.4, em có search thử, cũng có bài nói về hạn chế của pp này http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6W9V-4PB0PPP-1&_user=10&_coverDate=11%2F15%2F2007&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1376606699&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=bc7d4d77d4345165c579136ed4aff2c4

Như em đã nêu có cái trục trặc lớn là chuyện dùng mẫu set zero, có khi cán bộ hướng dẫn dùng là nước cất, khi lại là buffer, thấy chạy đi chạy lại nhiều lần vất vả quá hôm nay cán bộ lại lấy mẫu blank (900µl DTNB + 50µl buffer + 50µl cơ chất) để set zero luôn. :03: Em thấy hơi đắn đo 1 số vấn đề: Em nghỉ set zero là để máy lấy cái mốc từ đó mình đo blank và đo mẫu. Lấy Abs mẫu trừ cho Abs blank sẽ ra 1 Abs chênh lệch là Abs do chính ChE trong mẫu phản ứng tạo màu sậm hơn gây. Nhưng không hiểu là tại sao rất nhiều lần set zero là nước cất hay buffer thì lại ra giá trị âm - tại sao blank màu vàng thế kia lại cho ánh sáng xuyên qua nhiều hơn hơn cả nước cất được !!??
Con dùng mẫu blank để set zero theo suy nghĩ của em nó sẽ ra kết quả không chính xác vì set zero chỉ lấy 1 giá trị tức thời trong 1 lần chiếu sáng làm mốc, mà theo em thấy thì mẫu blank có phải ứng tạo màu thay đổi dần dần chứ không phải là 1 màu cố định (em theo dõi biểu đồ hôm trước đo mẫu blank thấy Abs thay đổi liên tục trong thời gian 3 phút đo), đo trong 3 phút là để nó lấy các giá trị Abs của nhiều lần chiếu sáng đưa vào công thức những thay đổi màu đó rồi đưa ra 1 giá trị Abs/min cuối cùng (em đang search công thức đó nhưng chưa ra). Do đó việc lấy mẫu blank làm zero sao chính xác được.

Một số suy nghĩ như trên làm ơn cho em xin ý kiến!

Chào bạn,
Trong thực tế khi đo quang, vẫn có nhiều lúc độ hấp thu mẫu thấp hơn độ hấp thu của mẫu trắng, tất nhiên mức độ chênh lệch không nhiều lắm nhưng vẫn rất đáng kể cho những phép phân tích cần độ nhạy cao.
Bạn chú ý kiểm tra xem độ đục của các dung dịch đem đo thế nào? Có khi độ đục rất nhỏ, mắt thường không phân biệt được nhưng vào mày thì thấy rõ ràng (bạn đo tại 410 nm trong khi phép đo độ đục thường đuơc thực hiện ở 440 nm, cũng không xa mấy). Tôi cũng hay gặp trường hợp tương tự thế: dung dịch có màu vàng nhạt đo tại 410 nm thì có độ hấp thu thấp hơn dung dịch không màu. Xem kỹ ra thì dung dịch không màu kia hơi đục.
Vài dòng góp ý
Thân ái

[tie.pok]

Chào viva.dawnsun,

Trước tiên, bạn xác định xem máy UV-VIS của bạn có hoạt động tốt không đã, bạn có thể chuẩn bị dung dịch Chromate như trong pp aoac 991_10 và kiểm tra xem tại 410 nm thì Abs có thuộc khoảng 0.186–0.210 hay không? Nếu muốn chính xác hơn hãy pha dung dịch Kali Dichromate (K2Cr2O7) - đã được sấy khô 2h - ở nồng độ 60.02 mg/L rồi đo tại 4 bước sóng chuẩn và so sánh với các giá trị chuẩn như hình sau

http://cA1.upanh.com/8.610.12818713.NPM0/UVVariandataK2Cr2O7.bmp

Nếu máy không chính xác thì không có gì phải bàn thêm. Vì bất cứ máy UV-VIS nào khi được bấm Zero sẽ bộ phận vi điều khiển "hiểu" ngay tín hiệu điện áp Detector Photodiode sau đó là 0 volt để hiển thị ra giá trị Abs = 0. (hãy tạm hiểu nôm na như thế).

Vì bạn cứ nhắc đi, nhắc lại là "thấy blank âm thì làm lại" còn "blank dương thì làm tiếp" nên tôi mới nghi ngờ máy của bạn trục trặc hoặc quy trình có sự nhầm lẫn.

Nếu máy chính xác, hãy lưu ý lời khuyên của bác ngvtuan là "cho mẫu blank vào rồi mới set 0" vì blank = mẫu trắng, mẫu nền do đó nên đưa nền về giá trị = 0. Bạn nên nhớ sau khi set zero của bất kỳ dung dịch gì thì giá trị Abs lập tức = 0.000 Abs, vì thế sau khi cho blank vào bấm set zero và nhìn thấy giá trị hiển thị về 0 thì lấy blank ra, thêm mẫu (trên nền blank đó), trộn đều, đưa vào đo.


Thực ra, đo kinetic khi làm enzym mà bạn không có máy 2 chùm tia và có bộ ổn nhiệt như của bác ngvtuan, thì sai số của kết quả sẽ khá lớn do quá trình phản ứng không ổn định. Nhưng điều này sẽ thảo luận sau vì trước mắt bạn cần giải quyết rõ ràng cái vướng mắc ở khâu blank kia đã.

[viva.dawnsun]

@ giotnuoctrongbienca: tôi cũng từng nghỉ là cuvet có vấn đề nên đã thử dùng nước cất set zero sau đó trút nước cất ra hết và dùng lại chính cuvet đó chứa blank đo thì kết quả vẫn là âm, mắt thường thấy ngay nước cất thì trong suốt còn mẫu thì vàng thế mà lại âm mới lạ

@ tie.pok: rất tiếc tôi không có điều kiện test bằng những dung dịch như bạn chỉ vì thời gian phân tích mẫu vô cùng gấp rút, tranh thủ từng phút một. Tôi cũng không rõ máy đang dùng có tích hợp bộ ổn nhiệt như bạn nói không (đang dùng máy Varian Cary 50 Conc).Còn phần bạn nói "blank = mẫu trắng, mẫu nền do đó nên đưa nền về giá trị = 0. Bạn nên nhớ sau khi set zero của bất kỳ dung dịch gì thì giá trị Abs lập tức = 0.000 Abs, vì thế sau khi cho blank vào bấm set zero và nhìn thấy giá trị hiển thị về 0 thì lấy blank ra, thêm mẫu (trên nền blank đó), trộn đều, đưa vào đo" là không làm được với quy trình đo ChE vì mẫu blank gồm cơ chất + DTNB + sodium phosphate còn mẫu thì gồm cơ chất + DTNB + dịch nghiền, tức mẫu thì thay sodium phosphate bằng dịch nghiền!

Và hiện nay như đã nêu không còn set zero bằng nước cất hay sodium phosphate nữa mà là set zero bằng chính mẫu blank luôn. Liệu có ổn không???

[tie.pok]

Chào bạn,

@ giotnuoctrongbienca: tôi cũng từng nghỉ là cuvet có vấn đề nên đã thử dùng nước cất set zero sau đó trút nước cất ra hết và dùng lại chính cuvet đó chứa blank đo thì kết quả vẫn là âm, mắt thường thấy ngay nước cất thì trong suốt còn mẫu thì vàng thế mà lại âm mới lạ

Như thế này thì càng phải test máy bạn à.

@ tie.pok: rất tiếc tôi không có điều kiện test bằng những dung dịch như bạn chỉ vì thời gian phân tích mẫu vô cùng gấp rút, tranh thủ từng phút một.

Tôi đọc trong AOAC 991_10 thấy có mục "D. Spectrophotometer Evaluation" nên thiết nghĩ việc phân tích của bạn gấp đến đâu thì cũng nên làm, ít nhất là sau khi bật máy lần đầu trong ngày.

là không làm được với quy trình đo ChE vì mẫu blank gồm cơ chất + DTNB + sodium phosphate còn mẫu thì gồm cơ chất + DTNB + dịch nghiền, tức mẫu thì thay sodium phosphate bằng dịch nghiền!

Quy trình gì mà lạ thế nhỉ, phân tích mà mẫu và blank không cùng hệ quy chiếu thì tính toán kết quả ra sao? Quy trình này có vấn đề rùi??? Hay là trong "dịch nghiền" của bạn đã có trộn sẵn dung dịch đệm phốt phát, nếu có đúng là trộn sẵn thì sai số lớn chắc chắn sẽ xảy ra.

không còn set zero bằng nước cất hay sodium phosphate nữa mà là set zero bằng chính mẫu blank luôn. Liệu có ổn không???

Quá là ổn đi, hii... Đó chính là điều tôi muốn gửi tới bạn từ bài trước.

[viva.dawnsun]

Quy trình gì mà lạ thế nhỉ, phân tích mà mẫu và blank không cùng hệ quy chiếu thì tính toán kết quả ra sao? Quy trình này có vấn đề rùi??? Hay là trong "dịch nghiền" của bạn đã có trộn sẵn dung dịch đệm phốt phát, nếu có đúng là trộn sẵn thì sai số lớn chắc chắn sẽ xảy ra.
Dịch nghiền không trộn sodium phosphate mà dịch nghiền chỉ có 1,5 ml KH2PO4/K2HPO4 pH 7,5 + não. Quy trình này đúng như Ellman (1961) hướng dẫn đấy chứ !!??


Trích:
Nguyên văn bởi viva.dawnsun View Post
không còn set zero bằng nước cất hay sodium phosphate nữa mà là set zero bằng chính mẫu blank luôn. Liệu có ổn không???
Quá là ổn đi, hii... Đó chính là điều tôi muốn gửi tới bạn từ bài trước.
Điều này mình có thảo luận ở post # 7
Như em đã nêu có cái trục trặc lớn là chuyện dùng mẫu set zero, có khi cán bộ hướng dẫn dùng là nước cất, khi lại là buffer, thấy chạy đi chạy lại nhiều lần vất vả quá hôm nay cán bộ lại lấy mẫu blank (900µl DTNB + 50µl buffer + 50µl cơ chất) để set zero luôn. Em thấy hơi đắn đo 1 số vấn đề: Em nghỉ set zero là để máy lấy cái mốc từ đó mình đo blank và đo mẫu. Lấy Abs mẫu trừ cho Abs blank sẽ ra 1 Abs chênh lệch là Abs do chính ChE trong mẫu phản ứng tạo màu sậm hơn gây. Nhưng không hiểu là tại sao rất nhiều lần set zero là nước cất hay buffer thì lại ra giá trị âm - tại sao blank màu vàng thế kia lại cho ánh sáng xuyên qua nhiều hơn hơn cả nước cất được !!??
Con dùng mẫu blank để set zero theo suy nghĩ của em nó sẽ ra kết quả không chính xác vì set zero chỉ lấy 1 giá trị tức thời trong 1 lần chiếu sáng làm mốc, mà theo em thấy thì mẫu blank có phải ứng tạo màu thay đổi dần dần chứ không phải là 1 màu cố định (em theo dõi biểu đồ hôm trước đo mẫu blank thấy Abs thay đổi liên tục trong thời gian 3 phút đo), đo trong 3 phút là để nó lấy các giá trị Abs của nhiều lần chiếu sáng đưa vào công thức những thay đổi màu đó rồi đưa ra 1 giá trị Abs/min cuối cùng (em đang search công thức đó nhưng chưa ra). Do đó việc lấy mẫu blank làm zero sao chính xác được.

Mình lo là các dung dịch trong mẫu blank có phản ứng thay đổi màu làm mình set zero ko đúng!??

[Teppi]

Cám ơn phần trả lời của các anh rất nhiều!

@tigerchem: điều kiện đo là rất lý tưởng, cuvet em rửa rất kỹ + không trầy, điện rất ổn định vì lab của em dùng điện từ trạm biến áp riêng của trường. Em nghĩ cần set zero trước chứ, việc zet zero cũng cho mình bít tình trạng máy có đạt chưa trước khi bắt đầu tiến hành đo mẫu. Nếu dung dịch blank kết quả âm so với zero là điều bất thường vì hóa chất lại trong hơn cả dung dịch zero là sai. Điều đắn đo lnhiều à dung dịch set zero và dung dịch chạy blank chính xác là gì?

Hi,

Có các nguyên nhân không thuộc phạm vi thực hành chuyên môn cũng khiến gây ra sự không ổn định và chạy giá trị đọc khi lấy chuẩn zero:

1- Rung động nguồn phát hoặc đầu dò, cũng tương tự tình trạng lệch nguồn phát hay đầu dò ở một mức độ nhỏ. Khi đó giá trị đọc cứ chạy lên chạy xuống liên tục. Mạch điện tử phải liên tục chạy hiệu chỉnh tín hiệu, đèn tín hiệu nhấp nháy liên tục.

2- Thực hiện lấy giá trị ngay khi máy vừa mở, nguồn vừa phát ra. Một số thiết bị cũ vẫn còn dùng một số đèn đốt tim. Thông thường, nếu máy chưa khởi động đủ nóng thì nguồn phát sẽ không đủ để đầu dò nhận được. Tuy nhiên, có trường hợp, mới bật máy lên, cường độ dòng và áp tăng đột ngột. Máy cũ lại thiếu thiết bị chống lấy tin hiệu nhiễu do quá dòng hay quá áp...thế là nó ghi nhận...Sau đó mạch bù sẽ làm việc với nhiễu này gây ra sự chênh lệch lớn. Sau đó , dòng-áp trở lại trạng thái bình thường thì nguồn phát không đủ gây sụt giảm ..mạch bù lại chạy tiếp...kết quả giá trị đọc giảm đi dần theo ...gây cảm tưởng sai lệch cho người thao tác.

3- Nhiễu áp do một vài linh kiện bên trong bị hỏng. Một số tụ cũ, điện trở chập chờn bên trong bị hỏng cũng gây nhiễu áp theo dạng xung. Nguồn phát sẽ không cấp phát đủ áp- dòng cho đèn do các linh kiện hỏng này ngốn lúc nhiều lúc ít, cho dù điện áp nguồn cấp là ổn định.

Thế câu hỏi của tôi đặt ra cho bạn với cán bộ hướng dẫn là :
- máy này đã được đưa đi kiểm định và hiệu chuẩn chưa? Ở đâu? lần gần đây nhất là lúc nào?
- Vị trí máy đặt có gấn cái máy hút chân không, máy khuấy, máy ly tâm hay máy bơm nào không?
- Phòng có bị rung động do những hoạt động xây dựng hay tương tự nào không?

Thân,

Teppi

[viva.dawnsun]

Thế câu hỏi của tôi đặt ra cho bạn với cán bộ hướng dẫn là :
- máy này đã được đưa đi kiểm định và hiệu chuẩn chưa? Ở đâu? lần gần đây nhất là lúc nào?
- Vị trí máy đặt có gấn cái máy hút chân không, máy khuấy, máy ly tâm hay máy bơm nào không?
- Phòng có bị rung động do những hoạt động xây dựng hay tương tự nào không?

Cám ơn anh, xin trả lời là
- Máy hoàn toàn chưa được hiệu chuẩn!
- Vị trí máy thì chỉ có cách máy đo ion khoảng 1m (máy này có tích hợp máy bơm loại nhỏ) nhưng máy này rất ít khi hoạt động cùng lúc với máy so màu của em
- Phòng hoàn toàn không bị rung động.
(nhiệt độ phòng 17)

[ngvtuan]

Cám ơn anh, xin trả lời là
- Máy hoàn toàn chưa được hiệu chuẩn!
- Vị trí máy thì chỉ có cách máy đo ion khoảng 1m (máy này có tích hợp máy bơm loại nhỏ) nhưng máy này rất ít khi hoạt động cùng lúc với máy so màu của em
- Phòng hoàn toàn không bị rung động.

(nhiệt độ phòng -17)

bạn và cán bộ hướng dẫn thực hiện chuyển giao quy trình trên máy chưa hiệu chuẩn mình thấy không ổn lắm bất kể việc chuyển giao có thành công hay không đều chưa đạt chuẩn.


Như em đã nêu có cái trục trặc lớn là chuyện dùng mẫu set zero, có khi cán bộ hướng dẫn dùng là nước cất, khi lại là buffer, thấy chạy đi chạy lại nhiều lần vất vả quá hôm nay cán bộ lại lấy mẫu blank (900µl DTNB + 50µl buffer + 50µl cơ chất) để set zero luôn. Em thấy hơi đắn đo 1 số vấn đề: Em nghỉ set zero là để máy lấy cái mốc từ đó mình đo blank và đo mẫu. Lấy Abs mẫu trừ cho Abs blank sẽ ra 1 Abs chênh lệch là Abs do chính ChE trong mẫu phản ứng tạo màu sậm hơn gây. Nhưng không hiểu là tại sao rất nhiều lần set zero là nước cất hay buffer thì lại ra giá trị âm - tại sao blank màu vàng thế kia lại cho ánh sáng xuyên qua nhiều hơn hơn cả nước cất được !!??


cán bộ hướng dẫn có khi dùng nước cất để zero có khi dùng đệm: như vậy cán bộ hướng dẫn chưa nắm vững quy trình này và chính cán bộ này cũng chưa thực hiện quy trình này bao giờ ?. bạn cần đổi cán bộ hướng dẫn khác.


Con dùng mẫu blank để set zero theo suy nghĩ của em nó sẽ ra kết quả không chính xác vì set zero chỉ lấy 1 giá trị tức thời trong 1 lần chiếu sáng làm mốc, mà theo em thấy thì mẫu blank có phải ứng tạo màu thay đổi dần dần chứ không phải là 1 màu cố định (em theo dõi biểu đồ hôm trước đo mẫu blank thấy Abs thay đổi liên tục trong thời gian 3 phút đo), đo trong 3 phút là để nó lấy các giá trị Abs của nhiều lần chiếu sáng đưa vào công thức những thay đổi màu đó rồi đưa ra 1 giá trị Abs/min cuối cùng (em đang search công thức đó nhưng chưa ra). Do đó việc lấy mẫu blank làm zero sao chính xác được.

theo mình bạn đang trục trặc ở vấn đề mẫu Blank, trong mẫu mà bạn cho là blank (900µl DTNB + 50µl buffer + 50µl cơ chất) có phản ứng tạo màu thay đổi dần dần thì không thể gọi là Blank được, trong mẫu blank không bao giờ có phản ứng xảy ra. như vậy bạn cần xem xét lại có hay không phản ứng xảy ra giữa DNTB vs Buffer vs cơ chất.

về các phương pháp xác định Cholinesterase bằng máy quang phổ UV-Vis đầu tiên là phương pháp Ellman (1961) trong PP này không chỉ rõ đâu là Blank để đem zero. còn phương pháp AOAC Offocial thì lại nói rõ Blank là gì (Dissolve 0.0396 g DTNB in ca 9 mL pH 7.0 phosphate buffer, add ca 15 mg NaHCO3, and dilute to 10 mL with same buffer. Keep frozen when not in use) ở mẫu Blank theo AOAC thì không có dung dịch cơ chất. như vậy theo mình mẫu Blank của bạn thử bỏ dung dịch cơ chất trong mẫu Blank của bạn !.
hoặc tại sao bạn lại không thử làm theo phương pháp mới AOAC ?. phương pháp Ellman (1961) quá cũ và cổ điển đã có hơn 50 năm rồi mà.