nobel234
01-10-2008, 08:41 AM
Tóm tắt
Việc định lượng đồng thời paracetamol (P) và Ibuprofen (I) trong chế phẩm được hòa tan trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng cao áp (SKLCA) pha đảo đã được nghiên cứu và thẩm định. Việc thăm dò dung môi để kết tủa protein trong mẫu huyết tương cho thấy tỉ lệacetonitril:protein thích hợp là 2:1. Dịch chiết sau khi loại tủa được tiêm trực tiếp vào hệ thống SKLCA để phân tích với hệ dung môi acetonitril - H3PO4 0.1% (55:45, tt/tt), phát hiện bằng detector PDA ở bước sóng 247nm (cho P) và 220nm (cho I). từ việc xây dựng đường chuẩn của các dung dịch chuẩn làm việc P (PVKN, lô 09040804, hàm lượng 99.17%) và I (PVKN, lô 26020603, hàm lượng 99.69%) với mẫu trắng là huyết tương (bệnh viện truyền máu và huyết học) đã loại protein, nồng độ P và I trong chế phẩm được hòa tan trong huyết tương người đã được định lượng. Giới hạn định lượng là 0.86-110 mg.ml-1 cho P và 0.52-67 mg.ml-1 cho I. Độ đúng cho việc định lượng P là 90.7% và cho việc định lượng I là 90.6%. Độ chính xác đạt được (% RSD) cho việc định lượng P là 1.72% và cho việc định lượng I là 0.73%. Giới hạn định lượng là 0.23 mg.ml-1 cho P và 0.26 mg.ml-1 cho I.
Đặt vấn đề
Hiện nay có nhiều chế phẩm là những "dược phẩm thay thế dược học" (pharmacetical equivalence / pharmacetical alternative). Tuy nhiên việc kiểm tra chất lượng thường qui chủ yếu dựa trên sự kiểm tra các tính chất lý hóa theo tiêu chuẩn định sẵn. Tuy nhiên việc đánh giá in vitro này không phản ánh thực sự hiệu quả trị liệu của một thuốc trong cơ thể vì sinh khả dụng của một thuốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố. Bộ y tế nước ta vẫn chưa có một hướng dẫn thử tương đương sinh học chính thức, việc nghiên cứu chỉ dựa trênhướng dẫn thử tương đương sinh học của ASEAN là chủ yếu. Để góp phần chuẩn bị cho công tác nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tài:" Định lượng đồng thời Paracetamol và Ibuprofen trong huyết tương người bằng phương pháp SKLCA" với mục tiêu:
- Thử độ hòa tan chế phẩm chứa Paracetamol và Ibuprofen
- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Paracetamol và Ibuprofen trong dịch sinh học bằng SKLCA.
Vật liệu và phương pháp:
1. Vật liệu:
1.1 Hóa chất, mẫu thử, mẫu trắng:
Tất cả hóa chất và dung môi sử dụng là loạitinh khiết phân tích, loại dùng cho SKLCA. P và I chuẩn làm việc được cung cấp từ Viện Kiểm nghiệm TP. HCM. Viên nén Y: TATANOL EXTRA (của Công ty PYMEPHARCO, số lot: 010605, VISA: VNA-1449-04) và viên nén đối chiếu R (lưu hành thị trường, số lot: 403671, VISA: VNB-0525-00) chứa 325mg P và 200mg I. Mẫu trắng sử dụng là huyết tương người được cung cấp từ Viện truyền máu và huyết học TP> HCM.
1.2 Dụng cụ:
máy thử độ hòa tan Pharmatest dùng cánh khuấy, hệ thống SKLCA Waters dùng detector PDA.
2. Phương pháp:
2.1 Thử nghiệm độ hòa tan:
• Theo phương pháp thử nghiệm độ hòa tan dùng cách khuấy của USP XXIII (5)
•Điều kiện thử nghiệm: 6 viên nén cho mỗi mẫu, dùng 900ml đệm phosphat (pH=7.2) cho mỗi viên nén trong một cốc, tốc độ khuấy 50rpm. Rút 10ml dịch hòa tan bằng bơm tiêm 12ml ở thời điểm qui định, lọc bằng giấy lọc. Bỏ 4ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 2ml dịch lọc cho vào bình định mức 10ml. Điền đến vạch bằng pha động. Lọc qua màng lọc milipore 0.45 mm sau đó định lượng bằng SKLCA.
•Dung dịch chuẩn: pha dung dịch P chuẩn và I chuẩn trong pha động có nồng độ 65 mg/ml và 40 mg/ml
•Định lượng bằng SKLCA dùng pha động là acetonitril - H3PO4 0.1% (55:45, tt/tt), cột Symmetry C18 (150 x 4,6mm; 3.5 mm), tốc độ dòng 1ml/phút, phát hiện ở bước sóng 220nm (detector PDA)
2.2. Định lượng P & I
•Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
- Dung dịch chuẩn P: hòa tan chính xác 22mg P trong 10ml acetonitril
- Dung dịch chuẩn I: hòa tan chính xác 13.4mg I trong 10ml acetonitril
- Dung dịch chuẩn trong huyết tương: hòa tan 500ml dung dịch chuẩn P và 500ml dung dịch chuẩn I trong 9ml huyết tương, rung trên máy lắc vortex để được dung dịch có nồng độ 110 mg/ml của P và 67 mg/ml của I. Kết tủa protein bằng cách tiêm thêm 1ml acetonitril vào 500ml dung dịch huyết tương này trong ống eppendorf, lắc trên vortex trong 1 phút, ly tâm ống eppendorf này ở tốc độ 13,000rpm trong 10 phút, loại bỏ tủa qua màng lọc 0.45 mm. Dịch lọc được dùng để pha dung dịch huyết tương chuẩn của P có nồng độ 0.86 mg/ml; 3.44 mg/ml; 6.88 mg/ml; 13.75 mg/ml; 27.5 mg/ml; và dung dịch chuẩn của I có nồng độ 0.52 mg/ml; 2.09 mg/ml; 4.19 mg/ml; 8.38 mg/ml; 16.75 mg/ml bằng cách pha loãng với mẫu trắng huyết tương.
•Chuẩn bị mẫu thử:
Tính khối lượng trung bình viên từ 20 viên nén Y và R, nghiền tất cả thành bột, cân chính xác bột này vào bình định mức 50ml, hòa tan với 20ml ethanol 96% và làm đầy bằng dung dịch H3PO4 0.1%. Lọc , loại bỏ 20ml dịch lọc đầu. Dịch lọc sau khi được pha loãng với huyết tương theo tỉ lệ 1:9, lắc trên máy lắc vortex trong 1 phút. Cho 500ml dịch huyết tương này vào 1ml acetonitril, lắc trên máy vortex trong 1 phút, ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 10 phút, lọc qua giấy lọc 0.45 mm để được dung dịch mẫu thử trong huyết tương dùng cho phân tích.
•Điều kiện phân tích SKLCA:
- Cột Water Symmestry C18 (150 x 4.6 mm; 3.5 mm) + cột bảo vệ (2 x 4.6 mm, 5 mm)
- Pha độngAcCN - H3PO4 0.1% (55:45, v/v)
- Tốc độ dòng: 1 ml/min
- Phát hiện: l = 220nm
:sangkhoai :sangkhoai :sangkhoai
Việc định lượng đồng thời paracetamol (P) và Ibuprofen (I) trong chế phẩm được hòa tan trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng cao áp (SKLCA) pha đảo đã được nghiên cứu và thẩm định. Việc thăm dò dung môi để kết tủa protein trong mẫu huyết tương cho thấy tỉ lệacetonitril:protein thích hợp là 2:1. Dịch chiết sau khi loại tủa được tiêm trực tiếp vào hệ thống SKLCA để phân tích với hệ dung môi acetonitril - H3PO4 0.1% (55:45, tt/tt), phát hiện bằng detector PDA ở bước sóng 247nm (cho P) và 220nm (cho I). từ việc xây dựng đường chuẩn của các dung dịch chuẩn làm việc P (PVKN, lô 09040804, hàm lượng 99.17%) và I (PVKN, lô 26020603, hàm lượng 99.69%) với mẫu trắng là huyết tương (bệnh viện truyền máu và huyết học) đã loại protein, nồng độ P và I trong chế phẩm được hòa tan trong huyết tương người đã được định lượng. Giới hạn định lượng là 0.86-110 mg.ml-1 cho P và 0.52-67 mg.ml-1 cho I. Độ đúng cho việc định lượng P là 90.7% và cho việc định lượng I là 90.6%. Độ chính xác đạt được (% RSD) cho việc định lượng P là 1.72% và cho việc định lượng I là 0.73%. Giới hạn định lượng là 0.23 mg.ml-1 cho P và 0.26 mg.ml-1 cho I.
Đặt vấn đề
Hiện nay có nhiều chế phẩm là những "dược phẩm thay thế dược học" (pharmacetical equivalence / pharmacetical alternative). Tuy nhiên việc kiểm tra chất lượng thường qui chủ yếu dựa trên sự kiểm tra các tính chất lý hóa theo tiêu chuẩn định sẵn. Tuy nhiên việc đánh giá in vitro này không phản ánh thực sự hiệu quả trị liệu của một thuốc trong cơ thể vì sinh khả dụng của một thuốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố. Bộ y tế nước ta vẫn chưa có một hướng dẫn thử tương đương sinh học chính thức, việc nghiên cứu chỉ dựa trênhướng dẫn thử tương đương sinh học của ASEAN là chủ yếu. Để góp phần chuẩn bị cho công tác nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tài:" Định lượng đồng thời Paracetamol và Ibuprofen trong huyết tương người bằng phương pháp SKLCA" với mục tiêu:
- Thử độ hòa tan chế phẩm chứa Paracetamol và Ibuprofen
- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Paracetamol và Ibuprofen trong dịch sinh học bằng SKLCA.
Vật liệu và phương pháp:
1. Vật liệu:
1.1 Hóa chất, mẫu thử, mẫu trắng:
Tất cả hóa chất và dung môi sử dụng là loạitinh khiết phân tích, loại dùng cho SKLCA. P và I chuẩn làm việc được cung cấp từ Viện Kiểm nghiệm TP. HCM. Viên nén Y: TATANOL EXTRA (của Công ty PYMEPHARCO, số lot: 010605, VISA: VNA-1449-04) và viên nén đối chiếu R (lưu hành thị trường, số lot: 403671, VISA: VNB-0525-00) chứa 325mg P và 200mg I. Mẫu trắng sử dụng là huyết tương người được cung cấp từ Viện truyền máu và huyết học TP> HCM.
1.2 Dụng cụ:
máy thử độ hòa tan Pharmatest dùng cánh khuấy, hệ thống SKLCA Waters dùng detector PDA.
2. Phương pháp:
2.1 Thử nghiệm độ hòa tan:
• Theo phương pháp thử nghiệm độ hòa tan dùng cách khuấy của USP XXIII (5)
•Điều kiện thử nghiệm: 6 viên nén cho mỗi mẫu, dùng 900ml đệm phosphat (pH=7.2) cho mỗi viên nén trong một cốc, tốc độ khuấy 50rpm. Rút 10ml dịch hòa tan bằng bơm tiêm 12ml ở thời điểm qui định, lọc bằng giấy lọc. Bỏ 4ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 2ml dịch lọc cho vào bình định mức 10ml. Điền đến vạch bằng pha động. Lọc qua màng lọc milipore 0.45 mm sau đó định lượng bằng SKLCA.
•Dung dịch chuẩn: pha dung dịch P chuẩn và I chuẩn trong pha động có nồng độ 65 mg/ml và 40 mg/ml
•Định lượng bằng SKLCA dùng pha động là acetonitril - H3PO4 0.1% (55:45, tt/tt), cột Symmetry C18 (150 x 4,6mm; 3.5 mm), tốc độ dòng 1ml/phút, phát hiện ở bước sóng 220nm (detector PDA)
2.2. Định lượng P & I
•Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
- Dung dịch chuẩn P: hòa tan chính xác 22mg P trong 10ml acetonitril
- Dung dịch chuẩn I: hòa tan chính xác 13.4mg I trong 10ml acetonitril
- Dung dịch chuẩn trong huyết tương: hòa tan 500ml dung dịch chuẩn P và 500ml dung dịch chuẩn I trong 9ml huyết tương, rung trên máy lắc vortex để được dung dịch có nồng độ 110 mg/ml của P và 67 mg/ml của I. Kết tủa protein bằng cách tiêm thêm 1ml acetonitril vào 500ml dung dịch huyết tương này trong ống eppendorf, lắc trên vortex trong 1 phút, ly tâm ống eppendorf này ở tốc độ 13,000rpm trong 10 phút, loại bỏ tủa qua màng lọc 0.45 mm. Dịch lọc được dùng để pha dung dịch huyết tương chuẩn của P có nồng độ 0.86 mg/ml; 3.44 mg/ml; 6.88 mg/ml; 13.75 mg/ml; 27.5 mg/ml; và dung dịch chuẩn của I có nồng độ 0.52 mg/ml; 2.09 mg/ml; 4.19 mg/ml; 8.38 mg/ml; 16.75 mg/ml bằng cách pha loãng với mẫu trắng huyết tương.
•Chuẩn bị mẫu thử:
Tính khối lượng trung bình viên từ 20 viên nén Y và R, nghiền tất cả thành bột, cân chính xác bột này vào bình định mức 50ml, hòa tan với 20ml ethanol 96% và làm đầy bằng dung dịch H3PO4 0.1%. Lọc , loại bỏ 20ml dịch lọc đầu. Dịch lọc sau khi được pha loãng với huyết tương theo tỉ lệ 1:9, lắc trên máy lắc vortex trong 1 phút. Cho 500ml dịch huyết tương này vào 1ml acetonitril, lắc trên máy vortex trong 1 phút, ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 10 phút, lọc qua giấy lọc 0.45 mm để được dung dịch mẫu thử trong huyết tương dùng cho phân tích.
•Điều kiện phân tích SKLCA:
- Cột Water Symmestry C18 (150 x 4.6 mm; 3.5 mm) + cột bảo vệ (2 x 4.6 mm, 5 mm)
- Pha độngAcCN - H3PO4 0.1% (55:45, v/v)
- Tốc độ dòng: 1 ml/min
- Phát hiện: l = 220nm
:sangkhoai :sangkhoai :sangkhoai