hỏi các bước tiến hành sắc kí

[shbk]

bạn nào có thể cho tôi biết bươc tiên hành của phương phap sắc kí lỏng hiệu năng cao? những ví dụ cụ thể về đánh giá nồng độ của chất nào đó
xin cảm ơn

[blueriver]

Blue mới làm quen với HPLC nên không biết nhiều lắm .Nhưng nếu bạn muốn biết thì Blue xin dc trả lời :
1>bạn phải rửa cột sắc kí .ít nhất là 30 phút với pha động có khả năng rửa giải tốt các hợp chất mà bạn đã phân tích trong lần trước đó.Nếu không biết thì bạn cần sử dụng nhiều loại pha động khác nhau để rửa cột .Thông thường khi bạn tiến hành sắc kí pha đảo thì bạn người ta hay dùng pha động là Ethanol :H2O (1:10) hoặc Acetonitril :H2O(1:10) .thời gian rửa cột thường khoảng 30 phút .Bạn có thể thay đổi thành phần của pah động đễ việc rửa cột trở nên nhanh hơn .Cũng xin nói thêm là mục đích của việc rửa cột là làm cho cột của bạn trở nên sạch hơn .Cũng xin lưu ý là nếu bạn không rửa cột cho sạch nhất là sau lần chạy pha động có thành phần đệm ,thì rất dễ dẫn đến tình trạng làm hư cột tách hay tắc các đường ống dẫn do sự tạo kết tủa của pha động hay mẫu phân tích của bạn với thành phần đệm hay mẫu phân tích trong lần chạy sắc kí trước đó .Pha động cuối cùng mà bạn nên sử dụng có thành phần tương tự như pha động mà bạn sắp chuẩn bị để chạy săc kí (ko cần thành phần đệm ).Nói thâm đây là công việc đầu tiên bạn nên làm trước khi tiến hành bước thứ hai để tiết kiệm thời gian .

2>chuẩn bị pha động (pha động chạy HPLC tùy thuộc vào chất mà bạn cần phân tích và loại cột mà bạn sử dụng là gì .Về nguyên tắc thì khi phân chia HPLC theo laọi cột thì có hai loại là sắc kí pha thường và sắc kí pha đảo .Với sắc kí pha thường thì loại cột (pha tĩnh )sử dụng có độ phân cực cao (ví dụ như cột silicagel ) khi đó pha đông có ít tính phân cực hoặc không phân cực .Và ngược lại với sắc kí pha đảo có cột (pha tĩnh ) mang tính ít phân cực ,khi đó pha động có tính phân cực cao (thường là MEOH hay ETOH ,ACEtoNitril ,pha với H2O thoe tỉ lệ thích hợp ).

Thông thường khi bạn phân tích một mẫu nào đó ,thì bạn sẽ có quy trình để làm theo . Tuy nhiên bạn có thể thay đổi tỉ lệ thành phần của pha động để có kết quả tốt nhất .Theo như những gì Blue làm trong thời gian vừa qua thì pha động của bạn phải chuẩn bị sao cho thời gian rửa phân tích một mẫu trong khoảng 7->20 phút là tốt nhất .

Nếu thời gian phân tích quá ngắn thì khả năng phân tách các peak sẽ kém có khả năng peak của chất cấn phân tích sẽ trùng chập dẫn đến làm sai lệch đáng kể ,nhưng nếu không ngại việc các peak bị trùng chập hay đơn giản là chỉ có 01 chất mà bạn phân tích cho tín hiệu khi qua dầu dò thì rất là tốt vì khi ấy peak sẽ gọn và đối xứng ,Tuy nhiên thời gian không nên quá ngắn vì như vậy mẫu cần phân tích đã bị rửa trôi chứ không còn đúng nghĩa là sắc kí (tách chất ).

Nếu thời gian phân tích quá dài đương nhiên là không có lợi về mặt kinh tế ,hơn nữa theo như Blue quan sát peak có thời gian lưu dài sẽ dễ bị bè rộng hay kéo đuôi dẫn đến sự bất đối xứng của peak và do đó làm sai lệch kết quả phân tích .Nguồn gốc của sự sai số so peak không đối xứng là do diện tích peak được tính theo hàm phân bố chuẩn hóa Gauss .Hàm gauss có tính đối xứng cao.Các tính hiệu đo dc số hóa sau đó dc xấp xỉ theo hàm phân bố gauss ,và cuối cùng là tình diện tích của peak .(Tích phân ) .

thời gian phân tích tùy thuộc vào độ phân cực của dung môi ,vào cột phân tích và cả chất phân tích .Theo nguyên tắc dung môi có độ phân cực càng giống với chất phân tích thì khả năng rửa giải càng mạnh ,như thế sẽ làm giảm thời gian phân tích .Và một điều nói hơi thừa là các chất phân tích liên kết với cột phân tích và do đó cần tính toán khi sử dụng dung môi tốt nhất ứng với loại cột sử dụng .

Bước cuối cùng trong khâu chuẩn bị pha đồng là bạn phải siêu âm để đuổi khí ,lưu ý thành phần đệm hay H2O sử dụng pha pha động cần phải lọc qua giấy lọc 45 micromet.trành tình trạng làm dơ cột .

3> Sau khi quá trình rửa cột và chuẩn bị pha động thì đây là lúc bạn chạy pha động .Thời g ian chạy ít nhất là 30 phút trước khi chạy mẫu để pha đông dc ổn định cho kết quả phân tích ổn định hơn .

4>xử lí mẫu ,cái này thì khi làm bạn sẽ có quy trình theo tiêu chuẩn riêng .Bước cuối cùng của quá trình này là bạn phải bơm mẫu qua giấy lọc 45micromet.

5>chạy máy,bạn cần thiết lập các thông số như nhiệt độ cột ,thể tích tiêm mẫu ,bước sóng hấp thu (với đầu dò UV )....đừng quên dường dẫn để lưu kết quả phân tích .

6>bạn cần cài đặt chương trình rửa cột với dung pha động mà bạn vừa phân tích .(rất quan trọng nếu không ngày hôm sau khi sử dụng thì cột sắc kí của bạn sẽ ko còn cho kết quả tin cậy nữa ,do bị nhiễm bẩn khó rửa giải ,hoặc là bạn sẽ phải mất nhiều thời gian hơn cho việc rửa cột )

7>Hoàn tất việc chạy sắc kí HPLC .
Có gì không đúng xin các anh em góp ý

[tigerchem]

Tỉ lệ là 1:9 chứ không phải là 1:10, ngoài nước cất tinh khiết (cất 2 lần khử ion) bạn có thể dùng dung dịch H3PO4 0.05%.
Nếu chạy mẫu mất 20 phút thì hơi dài, nhất là với HPLC gắn UV vì tuổi thọ của đèn có hạn, mình nghĩ thời gian khoảng 9-15 là được, nếu phải tiêm la75p thì thời gian đợi cũng rút ngắn, nếu thời gian lưu quá lâu thì bạn nên tăng chiều dài cột (thay cột).
Ngoài ra những chỉ dẫn của anh blue là rất chi tiết rồi .
Thân!

[giotnuoctrongbienca]

Tỉ lệ là 1:9 chứ không phải là 1:10, ngoài nước cất tinh khiết (cất 2 lần khử ion) bạn có thể dùng dung dịch H3PO4 0.05%.
Nếu chạy mẫu mất 20 phút thì hơi dài, nhất là với HPLC gắn UV vì tuổi thọ của đèn có hạn, mình nghĩ thời gian khoảng 9-15 là được, nếu phải tiêm la75p thì thời gian đợi cũng rút ngắn, nếu thời gian lưu quá lâu thì bạn nên tăng chiều dài cột (thay cột).
Ngoài ra những chỉ dẫn của anh blue là rất chi tiết rồi .
Thân!

Tôi thấy công đoạn đuổi khí hòa tan trong mobile phase là bắt buộc. Tốt nhất là sục pha động bằng một dòng khí He tinh khiết. Nếu lab không có điều kiện thì có thể đánh siêu âm cho thật kỹ.
Thành phần của dung môi rửa cột tùy thuộc vào tiền sử sử dụng cột và có thể thay đổi chứ không nhất định ở một tỷ lệ nào.
Thời gian chạy sắc ký không phải là thông số quyết định mà sự phân tách giữa các chất trong mẫu trên cột và thành phần mẫu phân tích mới là các yếu tố quyết định. Các peak kế nhau nên có hệ số R = 1.5 -2.0 là phù hợp. Đôi khi chúng ta phải chấp nhận thời gian chạy SK đến 60 phút cho những mẫu có thành phần phức tạp và số lượng cầu tử cần phân tích quá nhiều.
Như tigerchem nói, nếu thời gian lưu quá lâu thì trước nhất là thay đổi thành phần pha động, nếu chưa đuợc thì thay pha tĩnh (thay cột).
Vài dòng góp ý
Thân ái

[cbier01]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC): Lý thuyết, vận hành, hay chỉ là thực nghiệm!!! :017:
Chào các bạn, tôi là người đang làm việc với HPLC trong ngành dược và có nhiều điều muốn trao đổi với các bạn khi vận hành HPLC.
Đã bao giờ các bạn tự hỏi rằng tại sao ta phải đuổi khí trước khi tiến hành sắc ký, tại sao phải rửa cột ? Việc đuổi khí là cần thiết cho quá trình phân tách cột và nhận tín hiệu của detector tốt (đây là lý thuyết) :24h_035:. Ở nơi tôi làm, việc đuổi khí chỉ được thực hiện một lần với mổi chai pha động như MeOH, ACN, (với buffer tất nhiên phải được đánh siêu âm ngay khi pha) và phần việc còn lại là của Degasser Online. Và cho tới nay, cách làm này vẫn đạt được những yêu cầu khắc khe của ngành dược (lưu ý rằng tôi chỉ sử dụng Detector UV, DAD, Fluose còn với những loại đầu dò khác tôi chưa kiểm chứng được). Vậy thật sự có cần thiết phải đuổi khí bằng He hay Ar không? (hỏng biết luôn!)
Về vấn đề rửa cột thì mỗi phòng thí nghiệm, thậm chí mỗi người thực hiện mổi kiểu, ví dụ ở nơi tôi làm, việc rửa cột với 100% H2O là không được phép, nhưng bản thân tôi thì thỉnh thoảng vẫn làm vậy :24h_092:. Thời gian rửa cột thì có nơi rửa 1h , có nơi 2h thậm chí có nơi cả buổi hay cả ngày. Vậy thì rửa cột thế nào mới đúng? Theo kinh nghiệm của tôi thì cách rửa cột tốt nhất là làm theo hướng dẫn của manual (luôn có khi mua cột) nhưng một trình rửa cột như vậy nhiều khi cần 2-3h, bạn có thời gian ko? :mohoi (. Và cần lưu ý thêm rằng lượng dung môi qua cột cũng có ảnh hưởng đến tuổi thọ của cột đấy bạn ạ! Đừng mong chờ nơi bán cột hay một người nào đó chỉ dẫn cho bạn cách sử dụng cột tốt nhất, vì họ chẳng bao giờ biết được bạn dùng cột với mục đích gì, cho hoạt chất hay sản phẩm nào, chính bạn mới là người phải quyết định. Nhưng trước hết để quyết định đúng, chúng ta phải hiểu được những quy tắc cơ bản, và tôi rất sẵn lòng chia sẽ với bạn những kinh nghiệm nhỏ bé của tôi. Khi tiến hành rửa cột nên lưu ý những điều sau:

Nên rửa cột theo từng giai đoạn với pha động có độ mạnh từ thấp đến cao.
Khi sử dụng đệm muối, đặc biệt là đệm phosphate, cần rửa với H2O ít nhất 30 phút với cột có kích thước 250-4mm, với cột có kích thước khác có thể tăng hay giảm thời gian.
Hãy sử dụng MeOH thay cho ACN để rửa cột (điều này là do bản thân mình rút ra từ thực nghiệm)
Hãy hiểu rõ mình đang rửa cái gì và để chuẩn bị xác định hoạt chất gì, ví dụ: nếu bạn rửa cột sau khi chạy ở pha động MeOH-H2O 80-20 để chuẩn bị xác định một hoạt chất chạy ở tỷ lệ 100% MeOH --> Giai đoạn rửa cột với 100% là cần thiết.

Một trình rửa cột như vậy mất khoảng 45-90 phút và vẫn đảm bảo kết quả phân tích sau (tất nhiên là vẫn có 1% rủi ro không lý giải được :24h_120:)

Một vài ý kiến mong các bạn trao đổi :welcome (